《终极联盟》一代采用原创故事，这次的二代则是以前一阵子Marvel宇宙的重大事件Civil War为蓝本，让玩家亲身体验壮烈的英雄内战。在一场造成重大平民伤亡的惨剧之后，美国政府通过了超人类注册法案（Superhuman Registration Act），强制所有英雄向政府注册列管。然而英雄之间对此意见相左，甚至分成了注册派与反注册派两方，演变成超级英雄的内斗。

 　　游戏的故事先从Civil War的前导事件Secret War说起，SHIELD头头Nick Fury带领数名超级英雄入侵末日博士（Dr. Doom）的老家Latveria。游戏开始时玩家操控的是美国队长、蜘蛛人、金钢狼与钢铁人所组成的四人小队，游戏的操控和前作相似，A、B两键分别对应轻攻击与重攻击，不同的组合可以施展出具有浮空、击晕、倒地等效果的连段；按住RT右发射键不放配合A、B、X、Y键，则可使用蛛网射击、金刚爪连砍等特殊招式（一开始只有两种，其余的要等到特定关卡才能学会），十字键则可切换目前场上的其他英雄。这次的《终极联盟2》取消了一代的个人大绝招，改成了新的Fusion Attack英雄合体技：攻击敌人、集满Fusion量表以后，按住LT左发射键不放再以A、 B、X键指定一名英雄，就能让他／她与玩家目前操控中的英雄合力使出威力强大的双人攻击。 Fusion Attack分成标定（Targeted）、引导（Guided）与清场（Clearing）三种形态，不同英雄间可以组合出各式各样的合体技。以钢铁人与蜘蛛人的清场技为例，蜘蛛人会先用蛛网将四周的敌人拉至身边（连打A键可以网住更多的敌人），捕捉完毕之后，钢铁人会用胸前的Uni-Beam把敌人全部炸飞；同样是蜘蛛人，但是将搭档换成金钢狼，Fusion Attack就会变成蜘蛛人用蛛丝把金钢狼缠起来甩荡，最后再猛力抛出，击倒路径上的敌人。